落射熒光顯微鏡濾光片介紹

2021/06/03 NMOT

什么是熒光團

熒光團是能夠產生熒光的分子或分子的一部分。使用適當頻率的光照射時,熒光分子會從基態變成激發態。但是,處于激發態的分子是不穩定的。在很短的時間(一般是fs到ns級)就會釋放一個光子,使分子回到較低的能態。發射光的波長相比激發光的波長更長(能量更低),因為振動、聲子和熱能等機制會損耗一部分能量。除非被光漂白破壞——熒光團因光致化學損傷或共價鍵改變引起的不可逆破壞,單個熒光團能連續被激發。一個特定的熒光團在光漂白之前的平均激發和發射周期數取決于它的分子結構和局部環境;有些熒光團僅能發射幾個光子就迅速漂白,而有些熒光團要穩健得多,能夠經歷數千次甚至上百萬次周期才發生光漂白。


熒光顯微鏡濾光片

下圖的顯示了落射熒光顯微鏡中使用的典型熒光濾光片,這種顯微鏡的激發光和發射光都會通過顯微物鏡。對于特定應用,精心選擇合適的濾光片和反射鏡,能最大程度地提高信噪比。如右邊的原理圖所示,使用三種濾光片來增強熒光信號,同時濾除不需要的光。下面分別討論每種光學元件。

熒光顯微鏡濾光片原理

熒光顯微鏡的激發濾光片

激發濾光片只允許熒光激發波長峰值附近的窄帶波長通過。黃色熒光蛋白激發濾光片透過率大于90%的通帶是489到505nm;通帶之外的入射光被部分阻擋(透射區域附近),或者被完全阻擋(遠離帶通波段)。


熒光顯微鏡的二向色鏡

二向色鏡用來反射波長小于截止波長的光,透過所有其它的波長。在落射熒光顯微鏡中,二向色鏡將規定波長范圍的光引導至樣品和圖像平面。二向色鏡的截止波長是指透過率等于50%的波長。比如在右圖中,熒光蛋白二向色鏡的截止波長約為515 nm。

將一片二向色鏡相對入射光成45°放在實驗裝置中,激發光在二向色鏡的表面反射,然后通過物鏡入射到樣品上,而樣品發射的熒光通過二向色鏡,進入光電探測系統。雖然二向色鏡在熒光顯微鏡中起著至關重要的作用,但在阻擋不必要的光束時還不夠理想;通常情況下,波長小于截止波長的光有大約90%被二向色鏡反射,而波長大于這個值的光大約有90%透射。因此,部分激發光會和熒光一起透過二向色鏡。為了阻止這種不必要的光到達探測系統,除了二向色鏡還需要使用發射濾光片。


熒光顯微鏡的發射濾光片

發射濾光片能讓樣品產生的熒光到達探測系統,同時截止不必要的激發光。與激發濾光片類似,發射濾光片只允許熒光發射波長峰值附近的窄帶波長通過。比如在右圖中,熒光蛋白發射濾光片透過率大于90%的通帶是524到546 nm;通帶之外的入射光被部分阻擋(透射區域附近),或者被完全阻擋(遠離帶通波段)。


通道熒光探針EX激發濾光片波長(nm)EM發射濾光片波長(nm)DM二向色鏡(nm)
綠色FAM492518505
FITC(Fluorescein)495519507
Alexa Fluor 488499520510
黃色JOE520548534
VIC538554546
HEX533559546
TET521542532
CAL Flour Orange 560538559549
橙/紅ROX578604591
Cy3554566560
Cy 3.5578591585
Alexa Flour 568578603591
深紅Cy5649666658
Quasar 670647670569
Alexa Flour 633632647640
Cy5.5672690681
Cy7753775764
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熒光濾光片濾光片選型的一般原則是在成像端盡可能讓熒光,發射光透過,同時盡可能阻擋激發光,從而獲得高信噪比信號。一般會建議激發濾光片和發射濾光片的透射光譜有一定的距離,納宏光電推薦選擇8nm-12nm帶寬。

我們在判斷濾光片的參數一般會看透射率光譜,但往往熒光相對于激發光的強度非常弱,因此選擇濾光片更需要參考阻擋深度光譜圖,OD值,OD值更能直觀地反映濾光片對光的阻擋特性。在選擇激發濾光片和發射濾光片時,兩者的阻擋深度光譜交點(OD交點)是重要的判斷標準,一般要求寬場光源激發時交點OD值大于5,激光激發時大于OD6,以實現較好的熒光信噪比。

深圳納宏光電生產的熒光濾光片組,具有以下濾光片特點:

波長精準;

高信噪比;

深截止度;

高可靠性;

產品定制化程度高;


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